Родилась в московской дворянской семье писателя Владимира Егоровича Гиацинтова (1858—1933) и Елизаветы Алексеевны Венкстерн. Её дядя Алексей Венкстерн известен как пушкинист и автор шуточных пьес, а сестра Елизавета Владимировна была замужем за художником М. С. Родионовым (1885—1956).
В 1911—1912 годах училась на факультете истории Высших женских курсов в Москве, одновременно занималась драматическим искусством у актрисы МХАТа Е. П. Муратовой. В 1910 по конкурсу была принята в МХТ. На тот же год приходится пылкая влюблённость в неё поэта Сергея Соловьёва, который, будучи отвергнутым, 31 октября 1911 года выбросился из окна, после чего шесть месяцев содержался в психиатрической лечебнице.
Впервые выступила на сцене в 1911 в роли служанки в пьесе К. Гамсуна «У жизни в лапах». В 1911—1913 годах — сотрудница МХАТа. В 1912 году вошла в группу молодёжи, которая начала заниматься системой Станиславского и составила ядро 1-й Студии МХТ под руководством Л. А. Сулержицкого, занятия по системе вёл Е. Б. Вахтангов. В 1917 г. вышла замуж за своего двоюродного брата — офицера Эраста Николаевича Гиацинтова (1894—1975). Гражданская война разлучила её с мужем. Софья Гиацинтова продолжала артистическую карьеру в Москве, в то время как её муж вступил в Добровольческую армию и затем, при эвакуации из Крыма, оказался в эмиграции в Европе, а позже в США. В дальнейшем супругам удалось встретиться один раз, в 1923 году, когда актриса приезжала в Прагу на гастроли. В 1924 году Софья добилась расторжения брака, чтобы узаконить свои отношения с актёром Иваном Берсеневым (1889—1951). В Москве супруги жили в «доме актёров» по адресу: Брюсов переулок, 12. В 1913—1924 — актриса МХТ, в 1924—1936 — актриса и режиссёр МХАТа 2-го, в 1936—1938 — актриса Театра имени МОСПС (ныне Театр имени Моссовета), в 1958—1961 — актриса Московского драматического театра им. К. С. Станиславского. В 1938—1958 и 1961—1982 годах — актриса и режиссёр Московского театра им. Ленинского Комсомола (ныне Театр «Ленком»). В 1940-е годы театром руководил «триумвират» из Берсенева, Гиацинтовой и Серафимы Бирман. После смерти мужа Гиацинтова стала художественным руководителем (с 1952 г. главным режиссёром) театра и сохраняла этот пост до 1957 г. В 1958—1961 годах преподавала в ГИТИСе имени А. В. Луначарского. Совместно со В. С. Смышляевым вела класс в Белорусской драматической студии при МХАТе.
Подробно рассказала о своей семье и театральной судьбе в книге «С памятью наедине» (1985).