Одри Тоту родилась 9 августа 1976 года в Бомоне и получила своё имя в честь актрисы Одри Хепбёрн. Отец — Бернар Тоту, врач-стоматолог, мать — Эвелин Нюре, учительница. Когда Одри окончила лицей, родители оплатили ей двухнедельный курс в парижской театральной школе «Cours Florent».
Одри окончила музыкальную школу по классу фортепиано и гобоя. Владеет немецким, итальянским языком и хорошо говорит по-английски.
Попав на актёрские курсы, Одри окончательно решила связать свою жизнь с театром и кино. Переехав в Париж, она училась, работала секретаршей, снималась в телесериале на телеканале TF1 о сыщице Жюли Леско.
Свою первую роль Одри Тоту сыграла в телевизионном фильме «Сердце мишени» (1996), после чего исполнила несколько небольших ролей в телефильмах и телесериалах.
В 1998 году она победила в конкурсе юных дарований. Эта победа принесла ей первую заметную роль в кино — в фильме 1999 года «Салон красоты „Венера“» Тони Маршаль. После этого фильма была замечена критиками, её карьера стала стремительно развиваться. Жюри конкурса имени Сюзанны Бьянкетти вручило ей главный приз.
Зрителям во всём мире Одри Тоту известна как исполнительница главной роли в фильме «Амели» 2001 года (режиссёр — Жан-Пьер Жёне). Главная героиня фильма Амели Пулен во Франции и во многих других странах (например, в Японии) стала объектом поклонения — как и всё, что с ней связано. Родители стали называть именем Амели своих новорождённых девочек. Кафе «Две Мельницы», действительно существующее на Монмартре, стало после выхода фильма пользоваться огромной популярностью. Фильм «Взмах крыльев мотылька» был воспринят публикой и рекламировался прокатчиками как «Амели-2», хотя был снят ещё в 2000 году, то есть на год раньше «Амели». В 2004 году Тоту снялась в главной роли ещё в одном фильме Жёне — «Долгая помолвка».
Следующей её крупной ролью стала главная женская роль в фильме 2006 года «Код да Винчи», в котором Одри Тоту снялась с Томом Хэнксом.
В 2009 году Тоту сыграла легенду моды Коко Шанель в полнометражном фильме-биографии «Коко до Шанель» (Coco avant Chanel), который описывает восхождение иконы стиля от певицы кабаре до гуру дизайна; после этого актриса стала лицом марки французских духов Chanel No. 5, сменив Николь Кидман.
В 2010 году Тоту дебютировала на сцене парижского театра «Мадлен», сыграв главную роль Норы в пьесе норвежского драматурга Генрика Ибсена «Кукольный дом» в постановке режиссёра Мишеля Фо, который сыграл роль адвоката Хельмера, мужа Норы.